刺猬紫檀木材DNA條形碼鑒定研究
發(fā)布日期：2019-10-09
呂葉香1、鄧格求1、余鴻發(fā)1、余敏2、高俊蘭2、劉盛全2
（1、江門市紅木檢測(cè)有限公司；2、安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)林學(xué)與園林學(xué)院）
摘要 [目的] 評(píng)價(jià)三條DNA候選條形碼序列對(duì)刺猬紫檀木材的鑒定能力。[方法] 以不同產(chǎn)地采取的刺猬紫檀木材為研究對(duì)象，提取并擴(kuò)增核ITS2、葉綠體matK基因及葉綠體基因間隔序列ndhF-rpl32。采用BLAST和NJ樹法評(píng)價(jià)不同DNA條形碼候選序列的鑒定能力。[結(jié)果] ITS2序列具有最高的擴(kuò)增和測(cè)序效率，ITS2序列的平均種間遺傳距離也明顯高于種內(nèi)遺傳距離。[結(jié)論] ITS2序列可以將刺猬紫檀木材與其他同屬近緣紫檀屬樹種木材區(qū)分開來。
關(guān)鍵詞：刺猬紫檀；DNA條形碼；木材識(shí)別
DNA Barcoding for the Identification of Wood of Pterocarpus erinaceus Poir.
Abstract [Objective] To evaluate the species discrimination power of three candidate DNA barcoding locis for wood of Pterocarpus erinaceus. [Method] The wood of P. erinaceus originated from different sites in this study. DNA from the sapwood and heartwood of P. erinaceus was extracted. Three plant DNA barcodes were amplified, i.e., the nuclear DNA region ITS2, the chloroplast matK and the chloroplast intergenic spacer ndhF-rpl32. The identification ability of different sequences was evaluated by BLAST and NJ tree methods on Pterocarpus species resolution. [Result] ITS2 demonstrated the highest amplification and sequencing efficiency, and the mean of interspecific distances was higher than the mean of intraspecific distances. [Conclusion] The wood of P. erinaceus could be distinguished from other Pterocarpus species by using the rDNA-ITS2 sequences.
Key words: Pterocarpus erinaceus Poir.；DNA barcode；Wood identification
刺猬紫檀（Pterocarpus erinaceus Poir.）為豆科紫檀屬大喬木樹種，主要分布于西非國(guó)家，是我國(guó)紅木標(biāo)準(zhǔn)（GB/T18107-2000）中5屬8類33種紅木樹種之一。刺猬紫檀葉片、樹皮和樹根具有重要藥用價(jià)值，其內(nèi)含提取物具有治療慢性腹瀉、抗瘧疾和治療腸道寄生蟲感染等功效[1]。刺猬紫檀常被用來制作高檔家具和工藝品，深受消費(fèi)者喜愛和追捧。這也造成了刺猬紫檀砍伐量激增，直接導(dǎo)致該樹種野生資源日益枯竭。2016年，在南非約翰內(nèi)斯堡舉行的《瀕危野生動(dòng)植物種國(guó)際貿(mào)易公約》（CITES）第17次締約國(guó)大會(huì)上，刺猬紫檀被列入瀕危管制附錄二。
傳統(tǒng)的木材識(shí)別方法具有一定的局限性，難以將木材樹種準(zhǔn)確地識(shí)別到種的水平[2]。隨著研究水平和檢測(cè)手段的不斷發(fā)展和進(jìn)步，在傳統(tǒng)的木材識(shí)別技術(shù)的基礎(chǔ)上，其他領(lǐng)域的分析方法開始嘗試應(yīng)用到木材識(shí)別和鑒定中，極大地豐富了木材識(shí)別與鑒定的手段[3]。目前，國(guó)內(nèi)采用紅外光譜技術(shù)對(duì)于刺猬紫檀及其近緣種樹種木材的識(shí)別研究較多[4-6]，但采用DNA條形碼技術(shù)識(shí)別刺猬紫檀木材的研究還未廣泛開展。本研究以不同產(chǎn)地采取的刺猬紫檀木材為研究對(duì)象，提取并擴(kuò)增核ITS2、葉綠體matK基因及葉綠體基因間隔序列ndhF-rpl32。采用BLAST和NJ樹法評(píng)價(jià)不同DNA條形碼候選序列的鑒定能力，以期為利用DNA條形碼技術(shù)準(zhǔn)確地識(shí)別刺猬紫檀及其近緣種木材提供科學(xué)依據(jù)。
1 材料與方法
1.1 材料
本研究刺猬紫檀木材試樣分別產(chǎn)自非洲西部七個(gè)不同的國(guó)家，樣品信息和產(chǎn)地來源見表1和圖1。所有木材試樣在進(jìn)行DNA提取前均需用無菌刀片切除木材表面部分，并將木材試樣切成小片置于冷凍研磨儀中低溫制備成粉末后備用。
表1 樣品信息
Table 1 The detail of collected samples
圖1 樣品采集地
Fig. 1 Sites where the samples were collected
1.2 方法
1.2.1 DNA提取及純化
稱取500 mg木材粉末置于50 mL無菌離心管中，使用DNA提取試劑盒（DNeasy Plant Maxi Kit，QIAGEN）提取木材總DNA。由于木材DNA提取物中含有大量的PCR擴(kuò)增抑制物，將嚴(yán)重干擾后續(xù)PCR擴(kuò)增反應(yīng)，需對(duì)木材DNA提取原液進(jìn)行純化處理。木材DNA純化采用PCR擴(kuò)增模板純化試劑盒（High Pure PCR Template Preparation Kit，Roche）純化DNA提取物。
1.2.2 DNA條形碼序列的擴(kuò)增、產(chǎn)物純化及克隆測(cè)序
通過比較和分析GenBank已公布的紫檀屬細(xì)胞核ITS2、葉綠體matK基因和葉綠體基因間隔序列ndhF-rpl32，設(shè)計(jì)三對(duì)DNA條形碼序列擴(kuò)增引物。引物合成由生工生物工程（上海）股份有限公司完成。三條DNA條形碼序列擴(kuò)增引物信息和反應(yīng)體系見表2。PCR產(chǎn)物特異性通過1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后，采用EasyPure Quick Gel Extraction Kit（全式金）進(jìn)行膠回收純化回收，純化回收后的DNA條形碼片段克隆采用pEASY-T1 Simple Cloning Kit（全式金），并在固體LB平板中進(jìn)行培養(yǎng)和藍(lán)白斑篩選。將鑒定為陽性克隆重組子的菌液送至生工生物工程（上海）股份有限公司測(cè)序，為保證測(cè)序結(jié)果準(zhǔn)確性，每個(gè)樣品選擇5個(gè)獨(dú)立的克隆重組子進(jìn)行雙向測(cè)序。
表2 DNA條形碼PCR擴(kuò)增引物和擴(kuò)增反應(yīng)體系
Table 2 Primer pairs of DNA region and reaction conditions applied for the PCR amplification tests in this study
1.2.3 DNA條形碼序列的分析
測(cè)序結(jié)果采用Lasergene Suite 7軟件進(jìn)行正反向序列校對(duì)和拼接，去除引物兩端載體序列。采用MEGA 5.0軟件的Kimura two parameter（K2P）模型進(jìn)行DNA條形碼種間和種內(nèi)遺傳距離計(jì)算，統(tǒng)計(jì)序列的堿基組成、變異位點(diǎn)和信息位點(diǎn)等序列特征信息。采用BLAST方法對(duì)獲得的DNA條形碼序列在GenBank數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行相似性同源搜索。將GenBank中與刺猬紫檀DNA條形碼序列同源性序列較高的同屬其他種序列（見表3）與本研究獲取的DNA條形碼序列一起采用鄰接法（neighbor-joining, NJ）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，系統(tǒng)發(fā)育樹各分支的置信度用自舉檢驗(yàn)法（boot-strap text）作1000次可信度分析。
表3 紫檀屬序列GenBank登錄號(hào)
Table 3 GenBank accession number of Pterocarpus species
2 結(jié)果與分析
2.1 PCR擴(kuò)增和測(cè)序成功率
三條DNA條形碼候選序列的PCR擴(kuò)增和測(cè)序成功率結(jié)果如圖2所示。ITS2序列PCR擴(kuò)增成功率最高為93%，葉綠體基因間隔序列ndhF-rpl32最低為79%。核ITS2序列多拷貝存在于核基因組中，這可為降解為小片段的DNA擴(kuò)增提供有利的條件和保證[7]。由于在對(duì)木材DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)時(shí)，通常會(huì)出現(xiàn)非特異性擴(kuò)增和低豐度擴(kuò)增PCR擴(kuò)增條帶，如直接進(jìn)行測(cè)序無法獲得準(zhǔn)確的結(jié)果或出現(xiàn)測(cè)序失敗。為提高測(cè)序成功率本研究采用克隆測(cè)序的方法，結(jié)果顯示三條DNA條形碼候選序列的測(cè)序成功率均為100%。
圖2 DNA條形碼擴(kuò)增和測(cè)序成功率
Fig. 2 PCR and sequencing success rates of the three DNA barcode loci
2.2刺猬紫檀種內(nèi)及種間變異
通過對(duì)7個(gè)不同產(chǎn)地刺猬紫檀的三條候選DNA條形碼序列進(jìn)行多重比對(duì)，ITS2序列種內(nèi)存在2個(gè)變異位點(diǎn)，其中168bp位點(diǎn)T顛換為A，196bp位點(diǎn)G轉(zhuǎn)換為A，且這兩個(gè)變異位點(diǎn)均來自于馬里的CW021。通過BLAST同源性比對(duì)，不同產(chǎn)地的刺猬紫檀木材ITS2序列與GenBank已公布的刺猬紫檀（JN083478）ITS2序列的最大相似度值為99%。7個(gè)不同產(chǎn)地刺猬紫檀的matK和ndhF-rpl32種內(nèi)均為發(fā)現(xiàn)變異位點(diǎn)，且分別與GenBank已公布的刺猬紫檀（JN083542和JN083598）的matK和ndhF-rpl32序列的最大相似度值為98%。
對(duì)本研究獲得的刺猬紫檀以及GenBank下載的已公布的紫檀屬其他不同種的三種DNA條形碼的種間和種內(nèi)遺傳距離、堿基組成、變異位點(diǎn)和信息位點(diǎn)進(jìn)行分析（表4）。結(jié)果表明，ITS2序列的GC含量最高為67%，葉綠體基因間隔區(qū)ndhF-rpl32序列的GC含量最低為27%。三條候選DNA條形碼中，ITS2序列種間存在最多的變異位點(diǎn)和信息位點(diǎn)（圖3）。此外，ITS2序列的平均種間遺傳距離也明顯高于種內(nèi)遺傳距離。
表4 三條DNA條形碼序列特征
Table 4 The characteristics of the three DNA barcode loci
圖3紫檀屬木材ITS2序列種間序列變異位點(diǎn)
Fig. 3 The interspecific variable sites in ITS2 sequence of wood of Pterocarpus species
2.3刺猬紫檀及其同屬近緣種NJ樹聚類分析
本研究選取紫檀屬種間變異較大的ITS2序列構(gòu)建NJ樹（圖4），結(jié)果表明，不同產(chǎn)地的刺猬紫檀首先聚類為一支，bootstrap值支持率為100%，表現(xiàn)出明顯的單系性，其他紫檀屬樹種各自聚類。因此，ITS2序列可以準(zhǔn)確地將刺猬紫檀木材與其他同屬近緣紫檀屬樹種木材區(qū)分開來。
圖4 基于ITS2序列構(gòu)建的鄰接（NJ）樹
Fig. 4 Phylogeny tree obtained by the neighbor-joining
analysis based on ITS2 sequence
3 結(jié)論
刺猬紫檀木材ITS2序列擴(kuò)增和測(cè)序成功率最高，種間遺傳距離大于種內(nèi)遺傳距離，基于ITS2序列構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹能夠成功地將刺猬紫檀木材與其他同屬近緣紫檀屬樹種木材區(qū)分開來，但ITS2序列作為DNA條形碼無法將不同產(chǎn)地的刺猬紫檀木材準(zhǔn)確區(qū)分，對(duì)于刺猬紫檀木材產(chǎn)地溯源研究還需進(jìn)一步深入研究。
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